Bugün, sayısız araştırma meslektaşına neden olan sorundan bahsedelim - Western Blot (WB) deneyi. Bu görünüşte basit ama "tuzaklar" deneyiyle dolu, neden her zaman bizi tekrar tekrar tökezliyor? Şimdi başarısızlık nedenlerini birlikte gözden geçirelim.
I. Grup yok
Olası nedenler şunları içerebilir:
- Antikor sorunları: Antikor etkisiz, spesifik olmayan veya hedef proteine bağlanma olmayabilir.
- Örnek sorunları: Örnek, müdahale eden maddeler içerebilir, konsantrasyonda çok düşük olabilir veya zaten bozulmuş olabilir.
- Elektroforez sorunları: voltaj, zaman veya tamponun uygunsuz kullanımı gibi uygunsuz elektroforez koşulları.
- Aktarım sorunları: Transfer işlemi sırasında uygunsuz membran seçimi, transfer süresi veya transfer tamponu gibi sorunlar.
- Engelleme Sorunları: Engelleme çözümü uygunsuz olabilir veya engelleme süresi çok uzun olabilir.
- Boyama sorunları: Boyama reaktifi süresi dolabilir, duyarsız veya uygunsuz kullanılabilir.
Ekipman sorunları: Ekipman arızalanabilir veya uygun şekilde kalibre edilemez.
- Deneysel Operasyon Sorunları: Deneysel operasyon, yetersiz yıkama veya eşit olmayan numune yüklemesi gibi standartlaştırılmayabilir.
- Protein modifikasyonu sorunları: Hedef protein, antikor tanımayı önleyen translasyon sonrası modifikasyonlara tabi olabilir.
- Hedef protein ekspresyonu sorunları: Hedef protein, tespit edilen hücrelerde veya dokularda çok düşük bir ekspresyona sahip olabilir veya ekspresyonu olmayabilir.
İi. Yüksek arka plan
Olası nedenler şunları içerebilir:
- Yüksek antikor konsantrasyonu: Çok fazla antikor kullanmak, spesifik olmayan bağlanmayı arttırabilir, bu da yüksek arka plana neden olabilir.
- Antikor kalitesi sorunları: Antikor, yüksek spesifik olmayan bağlanmaya veya diğer proteinlerle çapraz reaksiyona sahip olabilir.
- Yetersiz bloke edici: Engelleme çözeltisi, membran üzerindeki spesifik olmayan bağlanma bölgelerini etkili bir şekilde kaplayamaz ve bu da yüksek arka plana neden olur.
- Membran sorunları: Membran kalitesiz veya kontaminasyona sahip olabilir, bu da yüksek arka plana yol açar.
- Eksik transfer: Transfer işlemi sırasında proteinler membrana tam olarak aktarılamayabilir, bu da yüksek arka plana neden olabilir.
- Yetersiz yıkama: Yıkama adımları, bağlanmamış antikoru veya diğer safsızlıkları etkili bir şekilde çıkaramaz ve bu da yüksek arka plana yol açar.
- Boyama reaktif sorunları: Boyama reaktifi çok hassas veya kararsız olabilir, bu da yüksek arka plana neden olabilir.
- Deneysel ekipman sorunları: Ekipman, yüksek arka plana yol açan sızıntı veya parazit olabilir.
- Protein Örnek Sorunları: Numune, protein bozunma ürünleri veya diğer safsızlıklar gibi büyük miktarda karışan maddeler içerebilir.
- Deneysel Operasyon Sorunları: Deneysel operasyon, uzun süreli inkübasyon süresi veya yüksek sıcaklık gibi standartlaştırılmayabilir.
III. Spesifik olmayan bantlar veya yanlış protein bant boyutları
Olası nedenler şunları içerebilir:
- Çok fazla hücre pasajı, farklı protein ekspresyon seviyelerine neden olan, tutarsız bant boyutlarına veya çoklu bantların varlığına yol açar.
- Protein numunesi bozulması, daha düşük protein moleküler ağırlığı veya çoklu bantların varlığına neden olur.
- İn vivo eksprese edilen protein örnekleri, tutarsız bant boyutlarına veya çoklu bantların varlığına yol açan asetilasyon, metilasyon, alkilasyon, fosforilasyon ve glikosilasyon gibi çeşitli modifikasyon formlarına sahip olabilir.
- Hedef protein, tutarsız bant boyutları veya birden fazla bant varlığı ile sonuçlanan çoklu izoformlar veya ekleme varyantları içerir.
